AF-Mikroeinstellungs-Tipps von John Reilly (Neuroanatomist) Die Autofokus-Mikroeinstellung (AFMA) ist ein Verfahren, das es einem Benutzer ermöglicht, kleine Fehler der Front - oder Rückfokussierung zu korrigieren. Es ist ein Feature, das nur bei bestimmten Modellen von Canon dSLRs (derzeit 50D, 7D, 5D Mark II, 1D Mark III, 1D Mark IV, 1Ds Mark III und 1D X) vorhanden ist. Die AFMA hat den größten Nutzen für Linsen mit schnellen Öffnungen (f2,8 und breiter), da die geringe Schärfentiefe bei weiten Öffnungen auch kleine Fokusfehler deutlicher macht. Dieser Tipp besteht aus zwei Hauptabschnitten, einer praktischen Zusammenfassung des Verfahrens für diejenigen, die direkt eintauchen wollen, gefolgt von mehr technische Diskussion, darunter einige DIY-Optionen für ein Test-Setup. Der einfachste Weg, um eine AFMA durchzuführen, ist ein kommerzielles Werkzeug wie das LensAlign MkII oder das DataColor SpyderLensCal (siehe untenstehende Diskussion zur Erläuterung allgemeiner Fehler von druckbaren Testdiagrammen und Moir-Patterns und einer vernünftigen Workaround). Stellen Sie das Werkzeug auf einen Tisch oder idealerweise ein kleines Stativ und stellen Sie Ihre Kamera auf ein stabiles Stativ. Der Abstand zwischen dem Kalibrierungswerkzeug und der Kamera sollte ungefähr das 25-fache der Brennweite des Objektivs (z. B. 85 mm x 25 2,1 m bis 7 Fuß) betragen, obwohl irgendwo innerhalb der Brennweite von 5 bis 50fach arbeiten. Beachten Sie, dass der Abstand von 25x Brennweite unabhängig von Sensorgröße 7 Füße für ein 85mm Objektiv auf APS-C, APS-H oder FF geeignet wäre. Wenn Sie ein Zoomobjektiv einstellen, den Abstand auf der längsten Brennweite abstimmen und die Kalibrierung mit der längsten Brennweite durchführen (beachten Sie, dass das neue 1D X ein Zoomobjektiv mit zwei separaten Einstellwerten für die langen und Breiten Enden). Für lange Objektive benötigen Sie eine Menge Platz. Richten Sie die Kamera so aus, dass das zentrale AF-Messfeld auf das Fokusobjektiv zentriert ist, und richten Sie die Kamera so aus, dass die Sensorebene parallel zum Fokusobjekt verläuft (mit den Visierpunkten im LensAlign oder mit dem SpyderLensCal). Beleuchtung ist wichtig - ideal, helle konstante Beleuchtung für das Fokus-Ziel und das Lineal, mit Beleuchtung für die letzteren abgewinkelt, um Reflexion zu vermeiden. Ich schlage vor, mit einem Paar Tischlampen, eine Beleuchtung der Herrscher von hohen Winkel, die andere Beleuchtung der Fokus Ziel. Ich benutze tatsächlich drei Lampen, jede 150 W-Äquivalent. Heres, was mein typisches Setup sieht aus: Wenn bequem, bis zu schießen tethered (youll Notwendigkeit, Bilder bei 100 zu überprüfen). Stellen Sie die Kamera im Av-Modus und der maximalen Blende ein, und für diesen Zweck ist es am besten, mit dem Picture Style auf Monochrom zu schießen (wenn Sie mit einem Objektiv wie dem 50L oder 85L in Farbe fotografieren, CA). Verwenden Sie eine Fernauslösung oder einen Selbstauslöser und die Spiegelverriegelungsfunktion. Greifen Sie auf die Einstellung C. Fn für AF-Mikroeinstellung (im Abschnitt AutofocusDrive) zu und wählen Sie 2: Anpassen durch Objektiv. An diesem Punkt gibt es mehrere Möglichkeiten, um Ihre Testaufnahmen zu nehmen. Sie können iterativ schießen bei -20, -10, 0, 10 und 20 und sehen, welche Paar von Einstellungen Klammer richtigen Fokus auf den Nullpunkt des Lineals, dann schmaler es weiter. Oder, Sie können bei jeder Einstellung von -20 bis 20 zu schießen. Der wichtigste Punkt ist, mehrere Aufnahmen an jedem AFMA-Einstellung, nicht nur ein oder zwei besonders in der Region, wo Ihre Einstellung endet, und nehmen Sie mindestens einige Aufnahmen starten Aus dem Unendlich-Fokus und einige ab dem minimalen Fokusabstand (MFD). Heres meine Strategie: Nehmen Sie einen Schuss auf Null und überprüfen Sie für die vorderen oder hinteren Fokus (z. B. wenn die Brennebene vor dem Nullpunkt auf dem Lineal, das ist vorne Fokus). Der vordere Fokus erfordert eine positive Korrektur, der hintere Fokus erfordert eine negative Einstellung. Ich schieße Einzelaufnahmen vom Unendlichkeitsfokus und überprüfe bei maximalem Zoom auf dem hinteren LCD, in Schritten von 5 Maßeinheiten dann, die weiter verengen, bis ich eine vorläufige AFMA Einstellung für dieses Objektiv habe. Dann schieße ich auf insgesamt 11 AFMA-Einstellungen 5 Einheiten auf beiden Seiten meiner Vorwahl. Bei jeder Einstellung schieße ich acht Schüsse, zwei aus der Unendlichkeit, dann zwei ohne Refokussierung, dann zwei aus dem MFD, dann zwei weitere ohne Refokussierung. Ich übertrage dann die Bilder auf meinen Computer und überprüfe sie bei 100. DPP zeigt die AFMA-Einstellung als Teil der EXIF-Daten (oder Sie können eine Post-it-Note an das Ziel mit der aktuellen Einstellung halten). Ignoriere alle offensichtlich unscharfen Aufnahmen, bei denen kein Teil des Lineals klar ist. Ich finde in der Regel, dass, wenn ich durch die Bilder, bei der Annäherung an die beste Einstellung, die Aufnahmen aus der Unendlichkeit ausgeschaltet werden, dann bei der besten Einstellung alle alle vor Ort sind, dann, wie ich wegziehen die Aufnahmen aus dem MFD ausgeschaltet werden, oder umgekehrt. Für mich dauert der gesamte Vorgang etwa 30 Minuten pro Objektivkamera-Kombination. Ich finde oft, dass 3-4 Anpassungswerte ok (z. B. 1 bis 3, so dass ich nur den Durchschnitt verwenden), in der Regel eine breitere Blende Linse mit dünner DoF gibt eine engere Auswahl. Einige andere wichtige Leckerbissen: die Kamera speichert bis zu 20 objektivspezifische Anpassungen nach Objektivtyp, so dass, wenn Sie mehr als eine Kopie eines Objektivs haben, kann die Kamera nicht sagen, sie auseinander (obwohl die 1D X können sie auseinander zu teilen Auf Objektiv-Seriennummer) zählt ein Objektiv plus Extender als zusätzliches Objektiv (und muss separat vom Objektiv kalibriert werden). Das ist die kurze Version lesen Sie für mehr Details und Theorie, oder wenn Sie es vorziehen, bis zum Ende für eine DIY-Vorschlag zu ersetzen, um eine kommerzielle Kalibrierung Werkzeug zu überspringen. Warum ist die AF-Mikroeinstellung wichtig Kameras und Linsen werden auf Fertigungsstraßen gefertigt, und Toleranzen gelten für jeden Herstellungsprozess eine gewünschte Spezifikation und eine Reihe von akzeptablen Werten um diese herum. Wenn youre glücklich, erhalten Sie eine Kamera und Objektiv, die beide auf der Stelle sind, oder sind von der gleichen Menge in die gleiche Richtung, und das Leben ist gut. Wenn Sie mehrere Linsen und Körper haben, sind die Chancen einer oder mehr braucht einige Anpassung. Der andere Faktor ist die Schärfentiefe (DoF), je breiter die Blende, desto flacher der DoF. Bei relativ schmaleren Blenden, wie dem f3.5-5.6-Bereich, der üblicherweise auf Verbraucher-Zoomobjektiven gefunden wird, ist das DoF tief genug, um kleinere Fokusfehler zu maskieren, so dass AFMA in diesen Fällen nicht so wichtig ist. Aber mit schnellen Objektiven, die flache DoF zu erreichen, sind auch kleine Fokusfehler sehr offensichtlich. Vor der Verfügbarkeit von AFMA, die einzige Option, um diese Probleme zu korrigieren war, Kamera (n) und Objektiv (en) in Canon zu senden und Sie mussten Ihre gesamte Kit an sie zu senden. Die Notwendigkeit von professionellen Fotografen zu haben, dass getan wurde Teil des Grundes Canon Canon Professional Services gestartet. Was ist AF-Mikroeinstellung AFMA korrigiert für Bias im AF-System, oder anders gesagt, es verbessert die globale Genauigkeit des AF-Systems. Die Ausdrücke Genauigkeit und Präzision sind manchmal (falsch) austauschbar - Genauigkeit ist Nähe zu wahr, während Präzision Wiederholbarkeit ist. Heres ein schematisches Beispiel: AFMA korrigiert für Genauigkeit, aber nichts für Präzision. In der Tat, es bewegt sich der Mittelpunkt - die durchschnittliche Brennebene von mehreren Messungen. Aber seine wichtige daran zu erinnern, dass Präzision spielt eine Rolle, wenn Sie also testen Sie Ihre AF-System mit nur einem oder ein paar Versuche, zufällige Chance sagt, dass Ihr Test wird nicht vor Ort aufgrund von Ungenauigkeiten. Wenn Sie also die AF-Leistung testen, müssen Sie mehrere Tests für ein gegebenes Objektiv durchführen und es sind weniger Tests für ein f2.8 oder schnelleres Objektiv erforderlich, da das AF-Messfeld höherer Genauigkeit durch ein solches Objektiv aktiviert wird. Ich vermute, dies ist, was hinter Canons Aussage, dass AFMA kann eine korrekte Fokussierung zu verhindern - wenn Sie eine Anpassung auf ein oder zwei Testaufnahmen Basis, und diese Schüsse waren relativ weit weg von der richtigen Fokalebene, dann im Durchschnitt die meisten Ihrer nachfolgenden Aufnahmen verpassen Fokus . Es ist bemerkenswert, dass, obwohl wir testen und AFMA auf der Grundlage der Tiefe des Feldes, was tatsächlich betroffen ist Tiefe des Fokus. Dies macht Sinn, weil das AF-System nicht steuern kann, was vor dem Objektiv ist, kann aber kontrollieren, was los ist hinter der Linse. Die Tiefenschärfe bezieht sich auf den Bereich des kritischen Brennpunkts, der den Sensor umgibt, und dieser Bereich ist ein Bruchteil von einem Millimeter dick. Canon spezifiziert die Genauigkeit des AF-Systems, um innerhalb einer Schärfentiefe für eine maximale Blende des Objektivs für Standard-Präzisions-AF-Punkte und innerhalb von 13 der Schärfentiefe für eine maximale Blende des Objektivs für hochpräzise AF-Messfelder, die durch aktiviert werden, zu bestimmen Schnellere Linsen (f2.8-Mittelpunkt auf den meisten Körpern, f4-Mittelpunkt auf 1-stellige Körper). Eine AFMA-Einheit entspricht 18 der Schärfentiefe einer gegebenen maximalen Blendenöffnung. Keine Kamera produziert ein perfekt fokussiertes Bild jedes Mal in jeder Entfernung, und kein Anpassungsverfahren wird das ändern. Was eine richtige AFMA tun kann, ist die Erhöhung der Anteil der Aufnahmen, die richtig fokussiert sind. Gibt es einen noch besseren Weg Wenn das Verfahren scheint wie eine Menge Arbeit, ist es ja, gibt es fast sicher bessere Wege. In einem Beitrag auf dem Canon Rumors Forum hat der Benutzer epsiloneri ein Verfahren zur Analyse des Kontrasts eines Fokusziels (Standardabweichung der Pixelintensitäten) beschrieben und die Daten mit einer parabolischen Kurvenanpassung geplottet, um die beste AFMA-Einstellung zu bestimmen. Dies sieht aus wie eine sehr genaue Methode, obwohl wahrscheinlich viel zu langwierig ohne eine Möglichkeit, die Analyse zu automatisieren (z. B. MATLAB oder ImageJ). In der Theorie sollte es möglich sein, einen genauen Fokus mit der Kontrasterkennung in der Live-Ansicht zu erzielen, wo keine Ausrichtung erforderlich ist, da der Bildsensor verwendet wird, um den besten Fokus zu bestimmen und dann mit der Phasendetektion AF zu vergleichen und dementsprechend zu korrigieren. In der Praxis ist dies etwas schwierig zu machen (weil der Akt des Verschiebens des Fokusringes, um zu sehen, ob Sie wirklich optimal fokussiert wurden, den Fokus ändert und Sie den Nullpunkt verlieren). Allerdings ist dies eine Idee, die Canon als eine halbautomatisierte Routine implementieren könnte, dh Einrichtung und Ausrichtung Ziel (Canon könnte eine zu verkaufen, und in geeigneter Weise überladen für sie, wie sie für andere kleine Stücke von Plastikhusten tun), dann die Kamera automatisch Bestimmt die optimale Einstellung. Datei, dass man unter gee, wäre es nicht schön Wenn es richtig gemacht, wird es perfekt Nein, das AF-System wird nie perfekt sein. Es gibt ein paar große Gründe dafür. Die erste ist, dass jedes System leidet an Zufälligkeit alle eine genaue AFMA tut, ist die Maximierung der Häufigkeit von Schärfentiefe, die Sie erhalten, aber es wird immer noch einige misses. Der andere Grund ist, dass das Fokusziel eine ideale Situation flach mit hohem Kontrast ist. Die Welt ist nicht aus Fokus-Ziele zusammengesetzt - wenn es war, wäre die Fotografie ziemlich langweilig. Die Komplexität von realen Szenen wird durch unsere Erwartungen noch verstärkt. Sie zielen auf Ihre Kamera und platzieren Sie sorgfältig das AF-Messfeld auf das Merkmal Ihres Motivs, auf das Sie sich konzentrieren möchten. Allerdings kann das AF-System nicht lesen Sie Ihren Geist alles, was sie tun können, ist auf der Region der höchsten Phasendifferenz im Bereich des AF-Messfeldes zu sperren. Beachten Sie, dass das tatsächliche AF-Messfeld größer ist als das kleine Feld, das den Punkt im Sucher darstellt. Sogar mit der Spot-AF-Funktion bei bestimmten Kameras (7D, 1D Mark IV und 1D X), die die effektive Größe des AF-Messfeldes reduziert, ist der tatsächliche empfindliche Bereich gleich oder etwas größer als die Darstellung im Sucher. Bei bestimmten Objekten, insbesondere bei spitzen Winkeln zur Kamera mit einem dünnen DoF, kann sich das AF-Messfeld auf eines von zwei verschiedenen Merkmalen verengen, die merklich unterschiedliche Brennebenen ergeben. Beide würden für das AF-System korrekt sein. Kostenlose Testmethoden, was ist falsch mit ihnen Es gibt ein paar Ansätze zur Durchführung von AFMA ohne eine der kommerziellen Tools. Man beinhaltet das Einrichten eines Moir-induzierenden Musters auf einem Computermonitor und das Auswerten des Fokus basierend auf der Live-Ansicht auf dem Kamerahinter-LCD. Das ist eine ziemlich einfache Methode, aber es hat zwei Probleme. Erstens ist es schwierig, das Setup ausrichten, so dass der Sensor ist parallel zum LCD-Bildschirm. Zweitens habe ich festgestellt, dass es eine Menge Ungenauigkeit in der Methode bei der Betrachtung eines Moir-Muster bei 10x Live-Ansicht, kann die Kamera bewegt werden hin und her ziemlich ein bisschen, ohne sehen eine spürbare Änderung im Muster auf der Rückseite LCD. Der andere kostenlose Ansatz umfasst ein Diagramm, das Sie herunterladen und ausdrucken, dann Position in einem 45 Winkel zu Ihrer Kamera, auf eine dunkle Linie konzentrieren und die Skalen an den Seiten, um Fokus zu überprüfen. Das Problem besteht darin, dass das Fokusziel (Linie) und die DoF-Skala in der gleichen 45-Ebene liegen, so dass das Ziel nicht orthogonal zum Sensor ist. Tatsächlich, was ist wahrscheinlich die beliebteste Version dieses Charts hatte eine ältere Version (noch verfügbar), wo Sie zwei Seiten gedruckt, dann schneiden Sie ein bis wie die alten Registerkarte Ein Steckplatz B Spielzeug ausgeschnitten aus einem Müsli-Box, und taped to Die andere Seite. Der Schöpfer stoppte diesen Ansatz aufgrund der Variabilität der Montage führt zu variablen Ergebnissen. Die aktuelle Version verwendet eine dunkle horizontale Linie als Fokus-Ziel, mit der Begründung, dass, weil die Linie horizontal ist, spielt es keine Rolle, um das AF-System, dass die Seite schräg ist, wird es immer noch als 2D horizontale Linie. Das ist wahr, aber dann ist es nur, den horizontalen linienempfindlichen Teil des AF-Messfeldes optimal zu aktivieren. Auf vielen Kameras, das wird nicht gut funktionieren. Der aktuelle xxD und der 7Ds f2.8-Sensor sind zwei diagonale Linien, was bedeutet, dass eine dünne Schwarz-in-Weiß-Linie horizontal nicht aktiviert wird, um diesen Sensor zu aktivieren. Für die RebelxxxD-Linie und den 5D5DII ist der f2.8-Sensor ein senkrechter, linienempfindlicher Sensor, der die horizontale Linie im Diagramm ignoriert. Also, dass horizontale Linie wird nur zu aktivieren, die f5.6 horizontalen linienempfindlichen Teil des Kreuz-Typ-Sensor in der Mitte AF-Punkt. Sie fragen sich vielleicht - warum hat der Typ machen die Grafik so, dass ich seine Vermutung, weil er entworfen, um es zu testen AF auf Nikon-Kameras, die nicht über die hochpräzise AF-Punkt-Fähigkeit - ihre Kreuz-Typ-Sensoren sind f5.6- Empfindlich in beiden Orientierungen, so dass eine horizontale Linie Ziel sollte gut sein. Der bessere DIY-Ansatz Wenn youd eher nicht ein kommerzielles Werkzeug für AFMA kaufen, wäre mein Rat, die wichtigen Eigenschaften dieser Werkzeuge mit preiswerten Ersatzstoffen neu zu erstellen. Heres was Id empfehlen. Es würde einen Karton, ein Buch, ein Maßband, einen Stäbchen oder Bleistift und einen Ausdruck dieses Fokusziels (dank Bob Williams für den Link) erfordern. Es könnte auf einem Tisch, oder sogar auf dem Boden, wenn nötig. Wenn Sie ein gutes Stativ haben, würden Sie verwenden, dass stattdessen die Kamera auf ein Buch. Das Fokus-Ziel wird auf die Box geklebt, unten niedrig, und der Stäbchenstift wird an der Kante des Kastens stecken, die vertikal auf dem Ziel zentriert ist. Der Stäbchen unterstützt das Maßband schräg. Beachten Sie die Messung auf dem Maßband, wo es neben dem Ziel geht - das ist Ihr Nullpunkt, an dem Sie die Fokussierung auf Vorder - oder Rückseite feststellen können (wenn Sie Ihre Bilder bei 100 auf Ihrem Computer überprüfen). Wählen Sie ein Buch mit einer Dicke, die das Objektiv etwa auf der Höhe der Mitte des Fokusziels zentriert. Das Setup würde so aussehen: Ich hoffe, dass dies einige der Fallstricke in AF-Systemen und die Vorteile und Verfahren für die Erreichung einer nützlichen AFMA klärt. Glückliche (und scharfe) ShootingAnalyzing Gele und Western Blots mit ImageJ Die folgenden Informationen sind eine aktualisierte Version einer Methode für die Verwendung von ImageJ zu analysieren, Western Blots aus einer jetzt veralteten älteren Seite. Wenn Sie auf der Suche nach einer umfassenderen Workflow-Option für Ihre Western-Blot-Analysen, besuchen Sie bitte meine Tutorial auf Bild Studio Lite. Ein kostenloses Softwarepaket von LI-COR Biosciences. Die Image Studio Lite-Software kann kostenlos von licorislite heruntergeladen werden. Zusätzlich zu den unten beschriebenen Funktionen für ImageJ bietet Image Studio Lite zusätzliche Funktionen zur Datenverwaltung sowie Annotationshilfsmittel für die Erstellung von druckfertigen Bildern Ihres Westerns. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) kann verwendet werden, um die Dichte (aka Intensität) von Banden auf einem Agar-Gel oder einem Western-Blot zu vergleichen. Dieses Tutorial geht davon aus, dass Sie Ihr Gel oder Blot durch den Visualisierungsschritt getragen haben, so dass Sie ein digitales Bild Ihres Gels in. tif haben. Jpg Png oder andere Bildformate (ein 16-Bit. tif wäre das bevorzugte Format, um die maximale Menge an Informationen im Originalbild beizubehalten). Wenn Sie einen Röntgenfilm auf einem Flachbettscanner scannen, stellen Sie sicher, dass Sie einen Scanner verwenden, der die Möglichkeit hat, Transparentfolien (d. H. Film) zu scannen und mit der Scannersoftware 16-Bit-TIFF-Bilder zu speichern. Siehe die Referenzen am Ende dieses Tutorials für eine Diskussion über die verschiedenen Möglichkeiten, wie Sie diesen Schritt schrauben können. Dies geht auch davon aus, dass du dein Blotbild nicht überbelichtet hast, als du es produziert hast. Für eine Erklärung, warum Überbelichtung wird Ihre Ergebnisse ruinieren, siehe diese Seite. Die hier beschriebene Methode verwendet die Gelanalyse-Methode, die in der ImageJ-Dokumentation beschrieben ist: Gelanalyse. Sie können es vorziehen, es anstelle der Methoden zu verwenden, die ich unten skizziere. Es sollte sehr wenig Unterschied zwischen den Ergebnissen aus den verschiedenen Methoden. Diese Version des Tutorials wurde mit ImageJ 1.42q auf einer Windows 7 64-Bit-Installation erstellt. 1. Öffnen Sie die Image-Datei mit FilegtOpen in ImageJ. 2. Die Gelanalyse-Routine erfordert, dass das Bild ein Graustufenbild ist. Die einfachste Methode, um in Graustufen umzuwandeln ist, zu ImagegtTypegt8-Bit zu gehen. Ihr Bild sollte wie Abbildung 1 aussehen. Abbildung 1. Ein hergestelltes Western-Blot-Bild wurde in ImageJ geöffnet. Die Information entlang der Oberseite des Bildes zeigt an, dass sich das Bild derzeit im 8-Bit-Modus befindet, wobei eine invertierende LUT (Lookup-Tabelle) verwendet wird. Die invertierende LUT stellt sicher, dass dunkle Bänder als höhere Dichtewerte aufgezeichnet werden. 3. Wählen Sie das Werkzeug Rechteckauswahl aus der ImageJ-Symbolleiste. Zeichnen Sie ein Rechteck um die erste Spur. ImageJ nimmt an, dass Ihre Bahnen vertikal verlaufen (so dass einzelne Bänder horizontal sind), so dass Ihr Rechteck hoch und schmal sein sollte, um eine einzelne Spur einzuschließen. Wenn Sie ein Rechteck zeichnen, das kurz und breit ist, wechselt ImageJ zu der Annahme, dass die Bahnen horizontal laufen (einzelne Bänder sind vertikal), was zu viel Verwirrung führt. Abbildung 2. Die erste Spur wurde mit dem Rectangular Selections-Werkzeug ausgewählt 4. Drücken Sie nach dem Zeichnen des Rechtecks über die erste Spur die 1 (Command 1 on Mac) - Taste (Command 1 on Mac) oder gehen Sie zum AnalyzegtGelsgtSelect First Lane Rechteck an Ort und Stelle. Die erste Spur wird jetzt hervorgehoben und haben eine 1 in der Mitte davon. 5. Klicken Sie mit der Maus in der Mitte des Rechtecks auf die 1. Spur und halten Sie sie auf die nächste Spur. Sie können auch mit den Pfeiltasten das Rechteck verschieben, obwohl dies langsamer ist. Zentrieren Sie das Rechteck über die Spur von links nach rechts, aber don8217t Sorgen über Auskleiden es perfekt auf der gleichen vertikalen Achse. Image-J automatisch das Rechteck auf der gleichen vertikalen Achse ausrichten, wie das 1. Rechteck im nächsten Schritt. 6. Drücken Sie 2 (Befehl 2 auf Mac) oder gehen Sie zu AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane, um das Rechteck über der 2. Spur einzustellen. A 2 erscheint in der Fahrspur, wenn das Rechteck platziert ist. 7. Wiederholen Sie die Schritte 5 6 für jede weitere Spur auf dem Gel und drücken Sie jeweils 2 (Befehl 2 auf Mac), um das Rechteck einzurichten (Abbildung 3). Abbildung 3. Platzieren Sie das Rechteck über jede Spur und drücken Sie jeweils 2, um das Rechteck einzurichten. 8. Nachdem Sie das Rechteck auf der letzten Spur eingestellt haben (durch Drücken von 2), drücken Sie 3 (Befehl 3 auf Mac), oder gehen Sie zu AnalyzegtGelsgtPlot Lanes, um ein Profilplot jeder Spur zu zeichnen. Fig. 4. Die Profildarstellung aus dem Beispiel Western-Blot. 9. Die Profildarstellung stellt die relative Dichte des Inhalts des Rechtecks über jeder Spur dar. Die Rechtecke sind von oben nach unten auf dem Profilplot angeordnet. Im Beispiel-Western-Blot-Bild entsprechen die Peaks im Profil-Diagramm (Abbildung 4) den dunklen Bändern im Originalbild (Abbildung 3). Da vier Bahnen ausgewählt wurden, befinden sich im Profilverlauf vier Abschnitte. Höhere Spitzen stellen dunklere Banden dar. Breitere Spitzen repräsentieren Banden, die einen breiteren Größenbereich auf dem ursprünglichen Gel abdecken. 10. Bilder von echten Gelen oder westlichen Blots haben immer etwas Hintergrundsignal, so dass die Spitzen don8217t bis zu der Grundlinie des Profilplots reichen. Fig. 5 zeigt einen Peak von einem realen Blot, bei dem etwas Hintergrundrauschen war, so daß der Peak oberhalb der Grundlinie des Profildiagramms schwebt. Es wird notwendig sein, die Spitze zu schließen, damit wir ihre Größe messen können. Abbildung 5. Real Western Blots haben oft etwas Hintergrundrauschen, so dass der Peak bis zur Basislinie reicht (perfekt weiß). 11. Wählen Sie aus der ImageJ-Symbolleiste das Werkzeug für die Geradeauswahl (Abbildung 6). Für jede Spitze, die Sie in der Profildarstellung analysieren möchten, zeichnen Sie eine Linie über die Basis der Spitze, um die Spitze zu schließen (Abbildung 5). Dieser Schritt erfordert einige subjektive Beurteilung auf Ihrem Teil zu entscheiden, wo die Spitze endet und das Hintergrundrauschen beginnt. Abbildung 6. Verwenden Sie das Gerade-Werkzeug, um die Basis jedes Peaks von Interesse zu schließen. Fig. 7. Der Peak aus Fig. 5 ist mit einer Linie dargestellt, die über die Basis des Peaks gezogen ist, um den Bereich des Peaks einzuschließen. 12. Beachten Sie, dass, wenn Sie viele Spuren markiert haben, die späteren Bahnen am unteren Rand des Profilplotfensters ausgeblendet werden. Um diese Bahnen zu sehen, drücken und halten Sie die Leertaste, und klicken Sie mit der Maus und ziehen Sie die Profildarstellung nach oben. 13. Wenn jeder Peak an der Basis mit dem Geradenauswahl-Werkzeug verschlossen wurde, wählen Sie das Werkzeug Ständer aus der ImageJ-Symbolleiste (Abbildung 8). Abbildung 8. Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug, um alle interessierenden Ziffern auf dem Profil zu markieren. 14. Ziehen Sie die Profilleiste mit der Leertaste und der Maus nach unten, bis Sie wieder auf der ersten Spur sind. Klicken Sie mit dem Zauberstab-Werkzeug in die Spitze (Abbildung 9). Wiederholen Sie diese für jeden Peak, wie Sie gehen die Profil-Plot. Für jede Spitze, die Sie hervorheben, sollten die Messungen im Ergebnisfenster, das angezeigt wird, erscheinen. Abbildung 9. Klicken Sie mit dem Zauberstab auf die erste Spitze des Interesses. Der Peak sollte hervorgehoben werden, und im Ergebnisfenster sollte eine Messung erscheinen. 15. Wenn alle Peaks markiert sind, gehen Sie zu AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Dies kennzeichnet jeden Peak mit seiner Größe, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtgröße aller hervorgehobenen Peaks. 16. Die Werte aus dem Ergebnisfenster (Abbildung 10) können in ein Tabellenkalkulationsprogramm verschoben werden, indem Sie EditgenCopy All im Ergebnisfenster auswählen. Fügen Sie die Werte in eine Tabelle ein. Abbildung 10. Die Ausgabe von Peaks in der Profildarstellung und Kennzeichnung der Peaks. In diesem Fall sind die Ergebnisse aus der Auswahl der oberen Bande in jeder der 4 Bahnen in dem Beispiel westlichen Blot aus Abbildung 1.Hinweis: Wenn Sie versehentlich klicken Sie an der falschen Stelle mit dem Zauberstab. Das Programm noch erfasst, dass geklickte Fläche als Peak, und es wird Faktor in die gesamte Fläche verwendet, um die Prozentwerte zu berechnen. Offensichtlich wird dies Ihre Ergebnisse skew, wenn Sie in Bereichen, die aren8217t Peaks klicken. Wenn Sie an der falschen Stelle klicken, gehen Sie einfach zu AnalyzegtGelgtLabel Peaks, um die aktuellen Ergebnisse darzustellen, die die falschen Werte anzeigt, aber wichtiger setzt den Zähler für das Ergebnisfenster zurück. Gehen Sie zurück zum Profil-Plot und fangen Sie an, wieder in die Gipfel zu klettern, beginnend mit dem ersten Höhepunkt des Interesses. Das Ergebnisfenster sollte löschen und beginnen, Ihre neuen Werte anzuzeigen. Wenn Sie sicher, dass Sie in allen der richtigen Peaks klicken, ohne versehentlich in falschen Bereichen klicken, können Sie zurück zu AnalyzegtGelsgtLabel Peaks und erhalten die richtigen Ergebnisse. Datenanalyse Mit den in eine Tabelle eingefügten Daten können Sie nun die relative Dichte der Peaks berechnen. Zur Erinnerung sind die von ImageJ berechneten Werte im Wesentlichen willkürliche Zahlen, sie haben nur Bedeutung im Kontext der Menge der Peaks, die Sie auf dem einzigen Gelbild ausgewählt haben, an dem Sie gearbeitet haben. Sie haben keine Einheiten von g Protein oder anderen realen Einheiten, die Sie sich vorstellen können. Die normale Vorgehensweise besteht darin, die Dichte der ausgewählten Bänder relativ zu irgendeinem Standardband auszudrücken, die Sie auch während dieses Prozesses ausgewählt haben. 1. Platzieren Sie Ihre Daten in einer Tabellenkalkulation. Einer der Spitzen sollte Ihr Standard sein. In diesem Beispiel verwenden wir den 1. Peak als Standard. 2. Teilen Sie in einer neuen Spalte neben der Spalte "Prozent" den Prozentwert für jede Stichprobe durch den Prozentwert für den Standard (den 1. Peak in diesem Fall 26.666). 3. Die resultierende Spalte von Werten ist ein Maß für die relative Dichte jedes Peaks, verglichen mit dem Standard, der offensichtlich eine relative Dichte von 1 aufweist. Abbildung 11. Berechnen der relativen Dichte für jeden der 4 hervorgehobenen Peaks. Wir verwenden die Probe 1 als Standard für dieses Gel. Die relative Dichte wird berechnet, indem der Prozentwert für jede Probe mit dem Prozentwert für den Standard dividiert wird. 4. In diesem Beispiel hat die 2. Spur eine höhere relative Dichte (1.86), die gut mit der Größe und Dunkelheit dieses Bandes im Originalbild übereinstimmt (Abbildung 1). Erinnern Sie sich, dass diese Daten für die obere Reihe von Bändern auf dem ursprünglichen Western-Blot-Bild sind. 5. Wenn Sie die Dichte der Proben auf mehreren Gelen oder Blots vergleichen möchten, müssen Sie die gleiche Standardprobe auf jedem Gel verwenden, um eine gemeinsame Referenz zu liefern, wenn Sie die relativen Dichtewerte berechnen. Weitere Informationen finden Sie in den folgenden Abschnitten. 6. Um auf signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen in einem Experiment zu testen, müssen alle Ihre Gele oder Blots mit dieser Methode gescannt und quantifiziert werden, und die Werte werden in Relative Dichte ausgedrückt, oder Sie können Relative Dichte behandeln Als ein Faltenänderungswert (dh eine relative Dichteunterschied von 2 zwischen einer Kontrolle und einer Behandlung würde eine 2-fache Änderung in der Expression anzeigen). Wenn Sie Analysen von Varianztechniken zum Testen Ihrer Daten verwenden, müssen Sie möglicherweise sicherstellen, dass Ihre relativen Dichtewerte normal verteilt sind und dass es eine Homogenität der Varianz zwischen den verschiedenen Behandlungen gibt. 7. Es ist anzumerken, dass einige Forscher die zusätzlichen Anstrengungen unternehmen, um einen Satz serieller Verdünnungen eines bekannten Standards auf jedem Blot einzuschließen. Unter Verwendung der seriellen Verdünnungskurve und der oben beschriebenen Quantifizierungstechniken sollte es möglich sein, Ihre Probenbänder in Form von Picogrammen oder Nanogrammen von Protein zu exprimieren. Ein ausführlicheres Beispiel mit Ladekontrollen. Wir verwenden Abbildung 12 als repräsentativen Westernblot. Bei diesem Blot werden wir so tun, als hätten wir vier Proteinproben (vier Pipettenlasten aus demselben Fläschchen Homogenat) geladen, sodass wir erwarten, dass die Dichten in jeder Spur äquivalent sind. Die obere Reihe von Stäbchen wird unser Protein von Interesse darstellen. Der untere Satz von Stäbchen stellt unser Ladungssteuerprotein dar, das dafür bestimmt ist, sicherzustellen, daß eine gleiche Menge an Gesamtprotein in jede Spur geladen wurde. Dieses Ladungssteuerprotein ist ein Protein, das vermutlich auf einem konstanten Niveau exprimiert wird, unabhängig von der Behandlung, die auf die ursprünglichen Organismen angewendet wird, wie z. B. Actin (obwohl viele Personen die Behauptung, dass Actin äquivalent in Behandlungen ausgedrückt wird, in Frage stellen wird). Fig. 12. Ein Beispiel eines Western-Blots mit einer unteren Reihe von Ladekontrollbändern. Häufig stellen diese Banden ein Protein dar, von dem angenommen wird, dass es äquivalent in allen Behandlungen, wie Actin, exprimiert wird. Betrachtet man die 12, hatten wir gehofft, äquivalente Mengen an Gesamtprotein in jeder Spur zu laden, aber nach dem Ausführen des Western-Blots variieren die Grße und Intensität der unteren Stäbe in jeder Spur ziemlich viel. Die beiden linken Spuren sind gleichwertig, aber die dritte Spur hat die Hälfte der Dichte (Grauwert) im Vergleich zu den Spuren 12, während Spur 4 die Hälfte der Dichte und die halbe Größe im Vergleich zu den Spuren 12 hat Werte des oberen Satzes von Bändern nicht direkt vergleichbar sein. We8217ll verwenden ImageJ8217s Gelanalyse Routine, um die Dichte und Größe der Blots zu quantifizieren, und verwenden Sie die Ergebnisse aus unserem loading-Kontrollen (unteren Banden), um die Werte für unser Protein von Interesse (obere Banden) zu skalieren. 1. Öffnen Sie das Western-Blot-Image in ImageJ. 2. Stellen Sie sicher, dass sich das Bild im 8-Bit-Modus befindet: Gehen Sie zu ImagegtTypegt8-bit. 3. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug, um ein Feld um die gesamte 1. Spur zu zeichnen (sowohl obere als auch untere Balken enthalten) 4. Drücken Sie 822018221 (oder Befehl 1 auf Mac), um das Rechteck festzulegen. A 822018221 sollte in der Mitte des Rechtecks erscheinen. 5. Klicken Sie in der Mitte des Rechtecks und halten Sie es über die 2. Spur. 6. Drücken Sie 822028221 (Befehl 2 auf Mac), um das Rechteck für die Spur 2 festzulegen. A 822028221 sollte in der Mitte des Rechtecks erscheinen. Wiederholen Sie die Schritte 5 6 für jede weitere Spur, und drücken Sie 822028221 (Befehl 2 auf Mac), um das Rechteck über jede weitere Spur einzustellen (siehe Abbildung 13). Abbildung 13. Jede Spur wurde durch Verschieben des Rechtecks über demselben markiert und mit 822028221 gesetzt Wenn Sie die letzte Spur platziert haben (und 822028221 drücken, um sie festzulegen), können Sie 822038221 drücken, um ein Diagramm der ausgewählten Bahnen zu erzeugen (siehe Abbildung 14) (Mit Spur 1 oben, Spur 4 unten). Möglicherweise müssen Sie durch das Fenster scrollen, um alle Bahnen zu sehen. Das Profildiagramm stellt im wesentlichen den mittleren Dichtewert über einen Satz von horizontalen Scheiben jeder Spur dar. Dunkler Blots haben höhere Peaks, und Blots, die einen größeren Größenbereich (kD) bedecken, haben breitere Spitzen. In unserem Beispiel Western-Blot, sind die Bänder perfekte Rechtecke, aber Sie werden bemerken, eine Steigung in den Profil-Diagramm-Peaks, wie ImageJ Anwendung ein wenig Mittelwert der Dichtewerte, wie es bewegt sich von oben nach unten jeder Spur. Infolgedessen wird der scharfe Übergang von vollkommenem Weiß zu vollkommenem Schwarz auf den Bändern der Bahn 1 aufgrund der Mittelung in eine leichte Neigung auf der Profilzeichnung verschoben. 10. Auf unserem hier verwendeten idealisierten Western-Blot gibt es kein Hintergrundrauschen, so dass der Peak bis zur Grundlinie des Profilplots reicht. Bei echten Westernblots wird es Hintergrundgeräusche geben (der Hintergrund wird nicht ganz weiß sein), so dass die Spitzenwerte die Grundlinie des Profilplots erreichen (siehe Abbildung 5 oben). Infolgedessen muss jede Handlung eine Linie haben, die über die Basis der Spitze gezogen wird, um sie zu schließen. 11. Wählen Sie aus der ImageJ-Symbolleiste das Auswahlwerkzeug "Gerade Linie". Für jede Spitze, die Sie in der Profildarstellung analysieren möchten, zeichnen Sie eine Linie über die Basis der Spitze, um die Spitze zu schließen (Abbildung 7). Dieser Schritt erfordert einige subjektive Beurteilung auf Ihrem Teil zu entscheiden, wo die Spitze endet und das Hintergrundrauschen beginnt. 12. Wenn jeder Peak von Interesse mit dem Geraden-Werkzeug verschlossen wird, wechseln Sie in das Zauberstab-Werkzeug. Wir werden das Zauberstab-Werkzeug verwenden, um jeden Peak von Interesse zu markieren, damit Image-J seine relative Flächen-Dichte berechnen kann. 13. Wir beginnen mit der Hervorhebung der Ladekontrollbänder (untere Reihe) auf unserem Beispiel Western-Blot. Beginnen Sie am Anfang des Profils mit dem Stab, um in den ersten Peak zu klicken (Abbildung 15). Der Peak sollte hervorgehoben werden, nachdem Sie darauf geklickt haben. Klicken Sie auf die Ladekontrollspitzen für die anderen Bahnen. Wenn eine Spur am unteren Rand des Profils nicht sichtbar ist, halten Sie die Leertaste gedrückt und klicken und ziehen Sie den Profildiagramm nach oben, um die verbleibenden Bahnen anzuzeigen. Abbildung 15. Klicken Sie mit dem Zauberstab in die Ladekontrollspitze. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot).Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here).Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi:
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